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羥自由基測定試劑盒說明書 一、測定原理 Fenton反應(yīng)是zui常見的產(chǎn)生羥自由基的化學(xué)反應(yīng)，H2O2的量和Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的OH.量成正比，當(dāng)給予電子受體后， 用griess試劑顯色，形成紅色物質(zhì)，其呈色與OH.的多少呈正比關(guān)系。 二、試劑組成與配制：（50T/48樣） 試劑一：3%H2O2標(biāo)準(zhǔn)品儲備液0.5ml×1支，4℃保存3個月。0.03%標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液的配制：3%H2O2標(biāo)準(zhǔn)儲備液：蒸餾水=1：99稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。 試劑二：底物儲備液1ml×1支，4℃保存3個月。 底物應(yīng)用液的配制: 若您的樣本為產(chǎn)生羥自由基，即測定管吸光度比對照管吸光度低，則底物應(yīng)用液的配制：底物儲備液：蒸餾水=1：99稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。 若您的樣本為產(chǎn)生羥自由基，即測定管吸光度比對照管吸光度高，則底物應(yīng)用液的配制：底物儲備液：蒸餾水=1：299稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。 試劑三：甲液儲備液2ml×1支，4℃保存3個月，用時加蒸餾水1：9稀釋成應(yīng)用液。 乙液7ml×2支，4℃保存3個月。 試劑三應(yīng)用液的配制：甲液應(yīng)用液與乙液等比例混合，用多少配多少，余下4℃保存。 試劑四：液體10ml×1瓶，用時加蒸餾水稀釋至100ml，制備成應(yīng)用液，4℃保存。若有結(jié)晶，則放置37℃水浴至全部溶解后再稀釋。 試劑五：液體30ml×1瓶，避光4℃冰箱保存. 試劑六：液體30ml×1瓶，避光4℃冰箱保存. 試劑七：分析純的冰乙酸（冰醋酸）自備。 顯色劑的配制：試劑四應(yīng)用液：試劑五：試劑六：冰乙酸=8：3：3：2，需多少配多少，現(xiàn)用現(xiàn)配。 注：抑制羥自由基的物質(zhì)如：血清（漿）、各種組織勻漿液、口服液等； 產(chǎn)生羥自由基的物質(zhì)如：中性白細(xì)胞、某些藥物、部分植物等。 羥自由基測定試劑盒說明書 三、操作： 以上配制好的應(yīng)用液，先37℃水浴中預(yù)溫3分鐘，以下操作在37℃水浴中進行。
混勻，37℃反應(yīng)1分鐘（準(zhǔn)確以秒表計時），從加完試劑三開始到一分鐘結(jié)束，立即加入顯色劑終止反應(yīng)， 一次只能做一只管子。
混勻，室溫放置20分鐘后，1cm光徑，550nm，雙蒸水調(diào)零，測各管吸光度值。 *：參考取樣量：血清(漿)樣本用生理鹽水20倍稀釋后取0.2ml作檢測；若您有微量移液器，可直接取0.010ml 血清（漿），再加0.190ml生理鹽水。組織勻漿上清，取0.2ml檢測。具體取樣量需您自己做預(yù)試確定，詳細(xì)預(yù)試方法見附錄。 四、計算公式： 1、血清計算公式： 定義：規(guī)定每毫升血清（漿）在37℃下反應(yīng)1 分鐘，使反應(yīng)體系中H2O2 濃度降低1mmol/L 為一個抑制羥自由基能力單位。 抑制羥自由基能力（U/mL）=(對照OD 值-測定OD 值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD 值-空白OD 值）×標(biāo)準(zhǔn)品 濃度（8.824mmol/L）×(1mL/取樣量) ×樣本測試前稀釋倍數(shù) 2、組織計算公式 定義：規(guī)定每毫克組織蛋白在37℃下反應(yīng)1 分鐘，使反應(yīng)體系中H2O2 濃度降低1mmol/L 為 一個抑制羥自由基能力單位。 抑制羥自由基能力（U/mgprot）=(對照OD 值-測定OD 值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD 值-空白OD 值）×標(biāo) 準(zhǔn)品濃度（8.824mmol/L）÷[待測樣本蛋白濃度（mgprot/mL）×取樣量（0.2mL）] 3、溶血液計算公式： 定義：規(guī)定每毫克血紅蛋白在37℃下反應(yīng)1 分鐘，使反應(yīng)體系中H2O2 濃度降低1mmol/L 為 一個抑制羥自由基能力單位。 抑制羥自由基能力（U/mgHb）=(對照OD 值-測定OD 值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD 值-空白OD 值）×標(biāo)準(zhǔn) 品濃度（8.824mmol/L）×(1mL/取樣量) ×樣本測試前稀釋倍數(shù)÷血紅蛋白濃度（mgHb/mL） 4、產(chǎn)生羥自由基能力的計算公式： 定義：規(guī)定每毫升或每毫克物質(zhì)或每立方厘米內(nèi)106 個細(xì)胞在本反應(yīng)體系中使反應(yīng)液中H2O2 濃度增加1mmol/L 為一個抑制羥自由基能力單位。 抑制羥自由基能力（U/mL）=(測定OD 值-對照OD 值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD 值-空白OD 值）×標(biāo)準(zhǔn)品 濃度（8.824mmol/L）×(1mL/取樣量) ×樣本測試前稀釋倍數(shù) 五、注意點： 1. 必須每一支管子單獨做，并且反應(yīng)時間一分鐘一定要準(zhǔn)確。 2. 必須嚴(yán)格按照操作表順序加試劑，不可配制混合試劑。 3. 檢驗樣本溶劑或介質(zhì)可為生理鹽水、蒸餾水、醋酸、無水乙醇，但不能為緩沖液。 4. 此法檢測靈敏度較高，檢測血清（漿）和組織以外樣本時，先取原液及不同濃度稀釋后的樣本， 例如5倍稀釋液或10倍稀釋液做預(yù)試。如測定管顏色太淺可將樣本用其溶劑繼續(xù)稀釋至顏色深為止。 我所曾檢測花粉的水提液的活性氧，將其原液稀釋150倍后，顯色較好。 附錄 羥自由基佳取樣濃度及佳取樣量摸索方法 一、樣本處理 1. 血清（漿）：用生理鹽水將血清（漿）按1：1、1：4、1：9、1：19等稀釋成一系列不同濃度的血清（漿）， 分別取不同濃度的血清（漿）0.2ml按血清（漿）的測定操作表進行檢測。 2. 組織勻漿、細(xì)胞、線粒體或細(xì)胞膜等組織：分別用生理鹽水將組織勻漿稀釋成10%、5%、2%、1%、0.5%、0.1% 等一系列不同濃度的組織勻漿，分別取不同濃度的組織勻漿0.2ml按組織的測定操作表進行檢測。 二、操作步驟： 血清（漿）佳取樣濃度及佳取樣量的摸索舉例： 1. 樣本來源：正常組大鼠眼眶取全血，肝素抗凝取血漿測活性氧為例 2. 樣本稀釋：用生理鹽水將血漿按1：1、1：4、1：9、1：19、1：49、1：99稀釋成一系列不同濃度的血漿， 分別取不同濃度的血漿0.2ml按血清（漿）的測定操作表進行檢測。 3. 操作表
混勻，37℃反應(yīng)1分鐘（準(zhǔn)確以秒表計時），從加完試劑三開始到一分鐘結(jié)束，立即加入顯色劑終止反應(yīng)， 一次只能做一支管子。
混勻，室溫放置20分鐘，1cm光徑，550nm，蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度值。 4. 預(yù)試結(jié)果
5. 結(jié)論： 從上面的數(shù)據(jù)統(tǒng)計可以看出，抑制率（抑制率=（對照管OD-測定管OD）/對照管OD×在45%-55%之間 的佳取樣濃度為1：19.即1：19稀釋正常組大鼠血漿0.2ml進行羥自由基正式檢測。 三、討論 在您進行正式檢測前，需要從每組中取2-3個樣本進行上面的預(yù)試實驗，確定佳濃度和佳取樣量。在保證 抑制率【抑制率=（對照OD值-測定OD值）÷對照OD值×）】在20%-50%之間的同時，每組之間應(yīng)該有所差異，如有疑問，則需要重新摸索佳濃度和佳取樣量。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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