RT－PCR 已經成為研究者確定感興趣的器官、組織或細胞中mRNA 轉錄本出現、結構和表達水平的基本方法。RT－PCR的基本步驟包括：首先對樣品中出現的所有mRNA 合成一個cDNA拷貝，接著擴增感興趣的基因。因為兩個步驟中使用的反應緩沖液不能兼容，所以這兩個步驟（RT 和PCR）通常分別進行。即使有些試劑盒能將兩個步驟合而為一，但是同樣因為上述的緩沖液不兼容性，地限制了檢測靈敏度。Eppendorf 設計了一個含有全新化學物質的新試劑盒，使一步法RT－PCR 更加有效，在兩步法實驗中可以獲得更高的靈敏度。
簡介
逆轉錄（RT）以及隨后進行的PCR（RT－PCR）是RNA 分析中使用得zui廣泛的技術之一。如果需要平行分析多個RNA 樣品，方法為一步法RT－PCR。如果要擴增困難目標片段或從單一cDNA 池中擴增多重目標片段則會選擇兩步法。Eppendorf 推出的全新的cMaster RTplusPCR 系統適用于各種RT－PCR 應用。它含有一種全新的重組逆轉錄酶和一種具有高保真性的PCR 酶混合物。另外，RTplusPCR反應緩沖液能夠自動調節鎂離子濃度，因此這一重要成分的濃度無需優化。這種自我調節的效果是通過對鎂離子的弱螯合作用來實現的。如果鎂離子濃度過高，螯合劑會與過剩的鎂離子結合，如果反應（Taq 或DNA）需要鎂離子，鎂離子就會被釋放出來。這種創新技術提高了cMaster RTplusPCR的靈敏度和特異性。使cMaster RTplusPCR試劑盒既能進行一步法，又能進行兩步法RT－PCR，而且具有很大的動力學檢測范圍，能擴增得到的PCR產物長度范圍也很大（一步法反應zui長可擴增5.3 kb片段；兩步法方案zui長能擴增12.3 kb 片段）。
下面的實驗可以展示該試劑盒在不同應用中的表現。
實驗1關注新試劑盒在一步法RT－PCR 中的靈敏度。而在一步法應用中，zui重要的因素就是能夠采用盡可能少的目標材料進行有效工作。
實驗2顯示應用一步法方案進行長距離RT－PCR 不再是個難題。試劑盒中創新的緩沖液能同時保證逆轉錄酶和高保真酶混合物都具有延伸性。
本系統提供的兩步法RT－PCR 備選程序適用的模板范圍很廣。實驗3描述了對不同模板的擴增情況。這個新的系統能為所有的RT目標提供全面解決方案，不論需要擴增的片段是中等長度還是極長，不同來源的總RNA 中轉錄本是低豐度還是高豐度。
材料和方法
Eppendorf cMaster RTplusPCR系統
Eppendorf Perfect RNA Eukaryotic試劑盒
所有的PCR反應均在Eppendorf Mastercycler® gradient梯度PCR儀上進行。
實驗1：一步法靈敏度檢測RT－PCR
擴增目標：500 bp 的人α微管蛋白mRNA。
模板RNA：從人HELA細胞中純化的總RNA。反應中應用的模板濃度從1μg遞減至10pg。
方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR系統，標準一步法RT－PCR方案。1:10 稀釋RTplusPCR 緩沖液，鎂離子終濃度2.5 mM，反應總體積50μl
循環參數：
| 循環 | 步驟 | 溫度 | 時間 | 描述 |
| 1x | 1 | 50°C | 30分鐘 | 逆轉錄 |
| 1x | 2 | 94°C | 3分鐘 | 初始變性 |
| 40x { | 3 | 94°C | 15秒 | 模版變性 |
| 4 | 68°C | 45秒 | 引物退火/延伸 |
結果
 | cMaster RTplusPCR 系統顯示出一種依賴于模板RNA 量的寬廣的產物產量動力學范圍。能從低至10 pg 的HELA 總RNA中檢測到α微管蛋白mRNA。 |
實驗2：一步法擴增長片段RT－PCR
擴增目標：5.3 kb 的人結節性腦硬化因子（hTSF）mRNA&片段。
模板RNA：從人HELA 細胞中純化的總RNA。反應中應用的模板濃度為100ng和10ng。
方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR 試劑盒，針對長模板的特殊RT－PCR 方案。
設置一步法RT－PCR 反應。
| 成分 | 50μl RT－PCR反應體積 | 反應成分的終濃度 |
| 不含RNA 酶的水 | 2.5μl | |
| dNTP 混合物 每種dNTP 濃度均為10 mM | 2.5μl | 500μM |
| hTSF正向引物 | 1.0μl | 200 nM |
| hTSF反向引物 | 1.0μl | 200 nM |
| 總HELA RNA | 3.0μl | 每個反應中中含10ng－100ng |
| MasterMix 1 | 10.0μl | |
| 不含RNA 酶的水 | 34.0μl | |
| 含鎂離子的RTplusPCR 反應緩沖液 | 5.0μl | 1×；2.5 mM 鎂離子 |
| cMaster RT 酶 | 0.5μl | 0.15U /μl |
| cMaster PCR 酶混合物 | 0.5μl | 0.05U /μl |
| MasterMix 2 | 40.0μl |
循環程序參數
| 循環 | 步驟 | 溫度 | 時間 | 描述 |
| 1x | 1 | 65°C | 5分鐘 | 初始RNA變性 |
| 1x | 2 | 42°C | 60分鐘 | 逆轉錄 |
| 1x | 3 | 93°C | 3分鐘 | 初始變性 |
| 35x { | 4 | 94°C | 15秒 | 模版變性 |
| 5 | 59°C | 30秒 | 引物退火 | |
| 6 | 68°C | 5.5分鐘 | 引物退火 |
結果
 | 如圖2 所示，應用一步法RT－PCR 方法，可以從100 ng 和10 ng 總RNA 中檢測到5.3 kb 的hTSF PCR 產物。這個PCR 反應非常困難，大多數RT－PCR 試劑盒生物試劑廠家從未發布過應用一步法方案，有效擴增類似長度模板的結果。相反，Eppendorf 試劑盒能穩定可靠地從10 ng HELA 細胞RNA 中擴增該產物。 |
實驗3：兩步法RT－PCR
兩步法RT－PCR 的擴增目標：
500 bp 的（鼠和人）α微管蛋白mRNA pian段
1.3kb 的（鼠和人）腫瘤壞死因子受體（TNFR1）mRNA pian段
5.3 kb 的人結節性腦硬化因子（hTSF）mRNA pian段
12.3 kb 的鼠動力蛋白mRNA pian段
方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR 試劑盒，采用產品說明書中的針對普通長度模板和較長模板的兩步法RT－PCR 程序。所有的逆轉錄反應均采用0.5μg 的Oligo（dT）20 引物為引物。
設置*步RT 反應
| 成分 | 以Oligo（dT）20 為引物進行逆轉錄 | 反應成分的終濃度 |
| 不含RNA 酶的水 | 加至MasterMix 1 總體積為10μl | |
| dNTP 混合物 每種dNTP 濃度均為10 mM | 1.0μl | 1mM |
| Oligo（dT）20 引物（0.5μg /μl） | 1.0μl | 25ng/μl |
| 模版RNA | ||
| HELA (350ng/μl) | 3.0μl | } 1μg總RNA |
| A細胞(1 μg/μl) | 1.0μl | |
| L細胞(220ng/μl) | 4.5μl | |
| McCoy細胞(135ng/μl) | 7.0μl | |
| MasterMix 1 | 10.0μl | |
| 不含RNA 酶的水 | 5.0μl | |
| 含鎂離子的RTplusPCR 反應緩沖液 | 4.0μl | 2×；5 mM 鎂離子 |
| RTplusPCR 反應緩沖液 | ||
| cMaster RT 酶 | 1μl | 0.75U /μl |
| MasterMix 2 | 10.0μl |
設置第二步PCR 反應
| 成分 | 普通PCR（微管蛋白TNFR1） | 長片段（動力蛋白，hTSF） | 反應成分終濃度 |
| 不含RNA 酶的水 | 7.0μl | 6.0μl | |
| 正向引物 | 1.0μl | 1.0μl | 0.2μM |
| 反向引物 | 1.0μl | 1.0μl | 0.2μM |
| *步逆轉錄反應產物 | 1.0μl | 2.0μl | N / A |
| MasterMix 3 | 10.0μl | 10.0μl | |
| 不含RNA 酶的水 | 33.6μl | 32.0μl | |
| 含25 mM 鎂離子的RTplusPCR反應緩沖液 | 5.0μl | - | 1×；2.5 mM 鎂離子 |
| 含25 mM 鎂離子的 10×Tuning 反應緩沖液 | － | 5.0μl | 1×；2.5 mM 鎂離子 |
| dNTP 混合物/ 每種dNTP 濃度均為10 mM | 1.0μl | 2.5μl | 200μM（500μM） |
| cMaster PCR 酶混合物 | 0.4μl（2U） | 0.5μl（2.5U） | 0.04－0.05 U /μl |
| MasterMix 4 | 40.0μl | 40.0μl |
RT反應條件
| 步驟 | 溫度 | 時間 | 描述 |
| 1 | 65°C | 5分鐘 | 初始模版變性 |
| 2 | 0°C | 5分鐘 | 冷卻變性模版 |
| 3 | 42°C | 60分鐘 | *鏈cDNA合成 |
| 4 | -20°C | 直到PCR | 引物退火/延伸 |
注：動力蛋白的逆轉錄孵育時間延長至90 分鐘。
| 循環 | 步驟 | 溫度 | 時間 | 描述 |
| 1x | 1 | 94°C | 3分鐘 | 初始變性 |
| 35x { | 2 | 94°C | 15秒 | 模版變性 |
| 3 | 68°C | 40s/60s | 引物退火/延伸 |
* —— 微管蛋白
** —— TNFR1
hTSF 和動力蛋白的三步循環方案
| 循環 | 步驟 | 溫度 | 時間 | 描述 |
| 1x | 1 | 93°C | 3分鐘 | 初始模版變性 |
| 35x { | 2 | 93°C | 15秒 | 模版變性 |
| 3 | 56°C | 30秒 | 引物退火 | |
| 4 | 68°C | 12分鐘 | 引物延伸 |
不同大小目的片段所采用的延伸時間和退火溫度
| 目的片段 | 微管蛋白 | TNFR1 | hTSF | 動力蛋白 |
| 延伸時間（PCR） | 40秒 | 1分鐘 | 5.5 分鐘 | 12 分鐘 |
| 退火溫度 | 68℃ | 68℃ | 59℃ | 56℃ |
| 退火時間 | — | — | 30 秒 | 30 秒 |
| 每循環增加時間 | — | — | — | 20 秒 |
結果
 | 對5 種不同表達水平的基因進行RT－PCR。為了得到zui高的靈敏度，RT 和PCR 反應分開進行。如圖3 所示，對于α微管蛋白和TNFR1，我們可以應用兩步法RT－PCR 方法并將退火和延伸步驟合并為進行一次68℃ 孵育。如圖3 所示，無論片段長度大小和拷貝數高低，所有反應都可以順利進行。即使對于動力蛋白這種特別長（達12.3 kb）的稀有轉錄本，用cMaster RTplusPCR 系統也能夠進行有效擴增，而且結果具有的重復性，表明即使對于困難的RT－PCR 反應， Eppendorf 試劑盒也能獲得可靠結果。
|
cMaster RT 系統是為了給所有的RT 和RT－PCR 應用提供zui大的靈活性而設計的。該試劑盒結合了重組的同二聚體病毒逆轉錄酶和*的RTplusPCR 反應緩沖液系統，可以在較寬的溫度范圍（37℃－60℃）和0.2kb-12.5kb產物大小范圍內進行有效的cDNA 合成。cMaster RTplusPCR 酶混合物兼具熱穩定性DNA 聚合酶活性，校正功能輔助的保真性和高延伸效率。應用于一步法中，可以靈敏地檢測到極少量的總RNA 并擴增出長達5.3 kb的cDNA（參見圖1 和圖2） 兩步法方案可以從RT 反應中擴增多個目的cDNA，PCR產物的片段長度可增加至12.3 kb（參見圖3） 其他的擴展應用：系統的逆轉錄部分即cMaster RT 可以與任何PCR系統合用或者為其他下游應用如雜交實驗合成cDNA 探針。
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